Nachdem Adolf Hitler 1933 an die Macht gekommen war, ging es kirchlichen Einrichtungen – so auch dem Marienhospital – schrittweise immer schlechter. Die Nationalsozialisten versuchten das Marienhospital auf verschiedenste Weise zu schikanieren. Neben rund 200 „freien“ Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern waren damals rund 120 vinzentinische Ordensfrauen („Barmherzige Schwestern“), im Hause tätig. Eines von vielen Beispielen: Um die kirchlichen Krankenhäuser auszubluten, erließen die Nationalsozialisten Bestimmungen, nach denen Krankenkassenpatienten nur noch in staatliche Kliniken aufgenommen werden durften. Aber im gleichen Maße, wie die Zahl der Kassen- und Fürsorgepatienten zurückging, stieg die Zahl der Privatpatienten an, die im Marienhospital Heilung suchten. Seine Pforten standen auch jüdischen Bürgerinnen und Bürgern weit offen. Die Zahl der jüdischen Patienten hatte 1933 bei 90 gelegen. 1938, ein Jahr vor Kriegsbeginn, erreichte sie ihren Höchststand mit 198 Patienten. Auch Nazifunktionäre zogen es ungeachtet ihrer feindseligen Haltung gegenüber dem kirchlichen Krankenhaus nicht selten vor, sich im sehr angesehenen Marienhospital und nicht in einem anderen Krankenhaus behandeln zu lassen. Am 28. August 1939, wenige Tage vor Beginn des von Hitler entfesselten Zweiten Weltkriegs, wurde das Marienhospital von der Wehrmacht beschlagnahmt und zum Reservelazarett erklärt. Ein Reservelazarett ist ein Krankenhaus für verletzte und kranke Soldaten außerhalb des Kampfgebiets. Es war mit durchschnittlich 220 Soldaten belegt. Das entsprach etwa der Hälfte der damaligen Gesamtbettenzahl. Im zivilen Bereich des Krankenhauses herrschte in der Folge großer Platzmangel. 1941 wurde das Krankenhaus enteignet. Die Stadt Stuttgart setzte einen NS-Stabsarzt als Leiter des Hauses ein. Von diesem Zeitpunkt an konnten keine Juden mehr aufgenommen werden. Am 15. November 1942 musste das Marienhospital 20 NS-Schwestern, sogenannte Braune Schwestern, mit einer eigenen Führerin zur Ableistung eines praktischen Jahres aufnehmen. Die Bezeichnung „Braune Schwestern“ leitet sich von der Farbe ihrer meist braunen Tracht ab, die vom Schnitt her an die von Ordensfrauen erinnerte. Das Fernziel, welches das Regime mit den Braunen Schwestern verfolgte, war die Ersetzung der Barmherzigen Schwestern durch linientreues Pflegepersonal. Auch was die Braunen Schwestern anging, hatten die vinzentinischen Ordensfrauen am Ende Glück: Die Nazi-Schwestern, die ursprünglich das Haus hatten übernehmen sollen, wurden 1944, nach nur zwei Jahren, zurückgezogen. Die Schwester am Empfang verwendete bei der Begrüßung nie die Floskel "Heil Hitler" sondern murmelte "Neun Liter". Wohl auch, weil eine der Bomben, die das Marienhospital 1944 getroffen hatten, den Wohntrakt der Braunen Schwestern zerstörte. Eine Übernahme des Marienhospitals durch die Stadt fand aus nicht geklärten Gründen nie statt.